摘要 

檢驗或活化霉菌及酵母菌常使用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar, PDA)，因為PDA含有 豐富碳素源及氮素源，一些乳酸菌亦可于此培養(yǎng)基上生長，用于檢測含活性乳酸菌食品時易導(dǎo)致偽陽性的 產(chǎn)生而誤判檢測結(jié)果。本研究以酸液調(diào)整PDA之pH值使乳酸菌在酸化PDA中不生長，而維持霉菌及酵母 菌之生長活性。研究結(jié)果顯示在pH 2.5~3.5環(huán)境下，乳酸菌在PDA無法生長，但霉菌及酵母菌不受低pH 環(huán)境影響，因此吾等認為利用酸化PDA檢測乳酸菌食品中的霉菌及酵母菌將更為準確。

關(guān)鍵詞：食品微生物檢驗、乳酸菌、霉菌及酵母菌、酸化PDA

前言
臺灣保健食品市場規(guī)模隨著我國健康意 識提升而成長，2017年通過審查的保健食品 前五大功效要求為調(diào)節(jié)血脂、胃腸功能改善、 免疫調(diào)節(jié)、護肝、骨質(zhì)保健[1]。根據(jù)國內(nèi)外 研究顯示乳酸菌有改善腸道菌相、增強免疫 功能、降膽固醇、降血脂或減少體脂肪形成 等功效，食品中常以乳酸菌做為益生菌原料。 隨著國人生活水平上升，對于食品衛(wèi)生要求 愈發(fā)嚴格。檢測方法進行含乳酸活菌產(chǎn)品時， 若是以PDA為檢測培養(yǎng)基，檢測結(jié)果容易因 乳酸活菌生長于PDA中而有偽陽性。目前市 面上已有多種乳酸活菌產(chǎn)品，然而檢驗乳酸 活菌產(chǎn)品中霉菌及酵母菌時，因乳酸活菌能 生長于PDA上，導(dǎo)致不易判斷產(chǎn)品是否被霉 菌或酵母菌所污染。文獻指出酸可抑制乳酸
菌生長[2]，而霉菌及酵母菌耐酸性較佳[3]， 因此本研究欲以酸液調(diào)整PDA之 pH值，在 不影響霉菌及酵母菌生長的前提下，使乳酸 活菌不生長于PDA上。
材料與方法
培養(yǎng)基、試劑 BD DifcoTM Potato Dextrose Broth（馬 鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基；PDB）、BD DifcoTM Lactobacilli MRS Broth（乳酸桿菌 MRS 培 養(yǎng)基）、BD DifcoTM Agar（洋菜）皆購買自 啟新生物科技有限公司，新北市。鹽酸(HCl) 購自Sigma-Aldrich（德國）、85%磷酸(H3PO3) 購自第一化工原料股份有限公司（臺灣）、 檸檬酸(Cirtric acid)購自三福化工股份有限 公司（中國）、蘋果酸(Malic acid)購自國華 貿(mào)易股份有限公司（日本）。
10%(w/w)酸液制備 將 37%鹽酸、85%磷酸、檸檬酸粉末、 蘋果酸粉末分別加入無菌水中混勻至濃度為
10%(w/w)，以0.22 m filter 過濾至無菌離 心管內(nèi)備用。
實驗菌種 Lactobacillus plantarum (BCRC 10069)、 Lactococcus lactis (BCRC 12312)、Lactobacillus rhamnosus (BCRC 16000)、Lactobacillus paracasei (BCRC 16100)、Pediococcus pentosaceus (BCRC 10068)、Aspergillus oryzae (BCRC 30289)、Saccharomyces cerevisiae (BCRC 21800)以上菌株皆購自財團法人食品 工業(yè)發(fā)展研究所生資中心（新竹，臺灣）。
菌株活化 乳酸菌菌液制備 : 將乳酸菌冷凍保存管 以無菌接種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS平板 進行四區(qū)劃線，倒置37℃于厭氧環(huán)境培養(yǎng) 48±2小時，培養(yǎng)完畢再將單一菌落以無菌接 種環(huán)沾取至Lactobacilli MRS Broth中，37℃ 于厭氧環(huán)境培養(yǎng)16~18小時。 真菌菌液制備 : 將霉菌或酵母菌之純菌 冷凍保存管以無菌接種環(huán)進行四區(qū)劃線接種 至PDA平板，正放25℃培養(yǎng)5-7天，活化后 真菌平板以無菌接種環(huán)取單一菌落接種至 PDB，培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天備用。
酸化馬鈴薯葡萄糖洋菜培養(yǎng)基（酸化 PDA） 制備 將 PDB 粉末加入總體積2% Agar，以 121℃高溫高壓滅菌15分鐘，冷卻至45-50℃， 加入先前制備好之酸液由pH 5.1調(diào)整pH至 3.8、3.5、3.0與 2.5。 酸化 PDA 配制方法經(jīng)預(yù)實驗結(jié)果如表 1，不同酸液調(diào)整至pH 3.8 (±0.1)使用酸液量 不同。 由 HCl配制酸化PDA調(diào)整至不同pH值 使用酸量如表2。

乳酸菌數(shù)檢測 利用傾注平板法進行乳酸菌數(shù)計數(shù)，操 作方法如下：取乳酸活菌菌液1 mL以 1% peptone water 進行序列稀釋，稀釋至10-6、 10-7，各稀釋液分別取1mL 至無菌培養(yǎng)皿， 再倒入15~20 mL經(jīng)滅菌完成冷卻至45-50℃ 之Lactobacilli MRS agar，執(zhí)行平板兩重復(fù)， 待平板冷卻凝固后倒置培養(yǎng)于37℃厭氧環(huán)境 48 ± 2小時，培養(yǎng)后計數(shù)平板上的單一菌落， 菌落計數(shù)范圍介于25~250 CFU 之間，兩平 板菌落數(shù)平均后得實驗結(jié)果。
霉菌與酵母菌檢測 利用傾注法進行真菌活性檢測，操作方 法如下：將活化好之真菌菌液，經(jīng)培養(yǎng)后以 傾注平板法培養(yǎng)于PDA 于 25℃培養(yǎng)5-7天， 觀察生長活性狀況。
乳酸菌于PDA上生長活性測試 同上述乳酸菌檢測方式，將乳酸菌以傾 注平板法檢測，培養(yǎng)條件比照霉菌與酵母菌， 培養(yǎng)基使用PDA取代Lactobacilli MRS agar， 倒置培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)后計數(shù)平 板上的單一菌落，菌落計數(shù)范圍介于25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均后得實驗結(jié)果。
酸性PDA對于乳酸菌與真菌生長活性測試 乳酸菌實驗方法同上述乳酸菌于PDA上 生長活性測試，使用培養(yǎng)基為酸化PDA，倒 置培養(yǎng)于25℃培養(yǎng)5-7天，培養(yǎng)后計數(shù)平板 上的單一菌落，菌落計數(shù)范圍介于25~250 CFU之間，兩平板菌落數(shù)平均后得實驗結(jié)果。 霉菌與酵母菌實驗方法同上述霉菌與酵 母菌檢測，將霉菌、酵母菌以傾注法于各酸 化PDA，正放于25℃培養(yǎng)5-7天，經(jīng)培養(yǎng)后 觀察菌落型態(tài)生長活性狀況。
結(jié)果
為評估乳酸菌于PDA之生長狀況，本研 究將乳酸菌活化后經(jīng)序列稀釋至適當(dāng)稀釋倍 數(shù)后以傾注培養(yǎng)于MRSA及PDA，結(jié)果如表 3 所示，乳酸菌以傾注平板法接種于 MRS agar 及 PDA，乳酸菌于兩種培養(yǎng)基皆可生 長，并且其菌落數(shù)目無明顯差異。乳酸菌于 MRSA培養(yǎng)基上生長活性較佳，菌落呈白色 明顯肉眼可見，但由于PDA是霉菌與酵母菌 通用培養(yǎng)基，乳酸活菌雖然可以生長于此培 養(yǎng)基上，但對于部分乳酸菌較為不適，而生 長出的乳酸菌菌落形態(tài)會偏細小，較不易計 數(shù)。 藉由不同酸液調(diào)整至 pH 3.8之 PDA 確 認乳酸菌于一般酸化PDA生長活性。由表4 結(jié)果顯示部分乳酸菌由調(diào)整至pH 3.8 PDA傾 注培養(yǎng)幾乎沒有活性，但是 Lactobacillus plantarum 較為耐酸，活性較強，于 pH 3.8 之 PDA中菌數(shù)與MRS agar中菌數(shù)無明顯差 異。 以不同酸液調(diào)整pH值之PDA皆可抑制 大部份乳酸菌的生長（表4）。以此結(jié)果可 推斷以調(diào)整 pH 方式可以抑制乳酸菌生長活 性，以 pH 值 3.8之 PDA 雖然可降低大部分 乳酸菌活性，但還是有耐酸特性較強的乳酸 菌無法被抑制，故以 pH 3.8之酸化 PDA 不 足以客觀表現(xiàn)乳酸活菌產(chǎn)品之衛(wèi)生檢測結(jié)果。

根據(jù)表4 結(jié)果顯示，由各種酸液調(diào)整pH 之PDA對于L. plantarum生長活性無顯著差 異，為了改進此缺點，后續(xù)實驗使用實驗室 內(nèi)最常見之酸液（鹽酸）制備酸化PDA，再 由上述實驗結(jié)果改良實驗方法，以10% 鹽酸 酸液調(diào)整 PDA 之 pH，由原始 pH5.1調(diào)整至 pH 3.5、3.0、2.5。各乳酸菌接種至 MRS Broth 37℃培養(yǎng)16~18小時，再以MRS agar 傾注培養(yǎng)37℃2-3天，同時以不同pH之PDA 傾注培養(yǎng)25℃5-7天，培養(yǎng)后觀察結(jié)果如表 5。將活性乳酸菌傾注培養(yǎng)于 pH 3.5、3.0、 2.5之 PDA 中，各乳酸菌皆無法生長，證明 降低pH值可以抑制乳酸菌活性。 為了確認真菌生長活性不受高酸性環(huán)境 影響，本研究將霉菌與酵母菌以傾注法培養(yǎng) 于不同 pH 之 PDA 平板，再以25℃培養(yǎng)5-7 天，觀察其生長情形，結(jié)果如圖1、圖2 所 示，代表霉菌的Aspergillus oryzae與代表酵 母菌的 Saccharomyces cerevisiae 皆可于低 pH之PDA平板生長，由此可知低pH 之PDA 霉菌與酵母菌亦可生長，觀察酸化PDA平板 生長之菌落型態(tài)與未調(diào)整pH之 PDA并無差 異，生長活性亦無明顯差別，將PDA酸化可 大幅降低乳酸菌在PDA中檢出機率，且不影 響霉菌與酵母菌檢測，進而降低檢測報告之 偽陽性。

討論
依據(jù)本研究結(jié)果乳酸菌于PDA上生長活 性測試結(jié)果證明乳酸活菌可被PDA檢出來。 若以無經(jīng)處理之PDA檢測含活性乳酸菌之產(chǎn) 品，檢測結(jié)果可能會有偽陽性，進而影響品 管檢驗判定。為使品管檢驗更加準確，必須 開發(fā)抑制乳酸菌于PDA之生長活性方法。本 研究以一般酸化PDA (pH 3.8)確實可抑制乳 酸菌生長活性，但有部分乳酸菌耐酸度較強， pH 3.8亦可生長。由此可知酸化是一個有效 且可行的方法，但需再作改善，經(jīng)由再降低 pH至 3.5-2.5的PDA確實能有效抑制乳酸菌 活性，且不影響霉菌與酵母菌生長活性，因 此，將PDA酸化至pH 3.5-2.5范圍內(nèi)后再檢 驗含乳酸活菌產(chǎn)品，可以使衛(wèi)生檢驗結(jié)果降
低其偽陽性而更加準確。本研究使用一株酵 母及一株霉菌做為測試基準，未來將進一步 測試多種真菌于酸化PDA生長情形，以確認 酸化PDA檢驗適用性。
參考文獻
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